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DART 原位质谱 Q&A 第3期

1.    手动的熔点管是否可以实现自动进样?
可以,前期有配合熔点管的 Direct Tip Insertion 模块,不过已停产;可由镊柄模块替代使用,通过夹持的方式进样。有客户曾经尝试把一组熔点管绑到12-dip-it 玻棒支架上面,模拟12-dip-it的商品玻棒,实现自动进样。请注意,这样做的结果非常难以重现,降低DART的真实性能,因而,不宜推荐。
 
2.    钞票、笔迹、印章等纸张类样品如何通过 DART® 识别真伪?
对纸钞这类平面样品,DART® 配有平面扫描模块(3DS模块)可实现无损检测。将样品平整放入后,DART® 可通过扫描(双轨道控制,X-与Y-方向,自动与手动均可)指定区域的油墨和字迹,通过比对其信号的差异判断真伪。笔迹和印章的的鉴定与之类似。
 
3.    96- 高通量扫描模块的功能是什么,如何工作?
高通量扫描模块用于液体定量,可视为放大版的 TM 透射或 QuickStrip 模块。同样使用金属筛网,但提高了通量(最多96个样品),也是通过双轨道(X-与Z-方向)控制。有专用的运行方法(Method),可按设置的样品数量和起始位置自动进行扫描。2017年的 ASMS 新品 DART®-HT 型号,即为改进版的96- 高通量液体样品扫描模块。
 
4.    固相微萃取(SPME)模块的配置和工作方式是怎样的?
目前有两款 SPME 模块,C18 或 PDMS/DVB 固相材质,都标配5个样品盘(即常用的96孔板)、一个小型摇床、两个针架(可放置12个 SPME 富集针)。工作时,一批样品(12个或更多)的振荡萃取完成后,在 DART® 上进行扫描的同时,另一批样品则可进行下一批次的振荡萃取。
 
美国东海岸某新药研发公司,采用10盒共 960 根 C18 富集针,处理生物发酵液,寻找低丰度活性代谢物,一天内即完成所有样品分析,效率提高近十倍!客户盛赞灵敏度和通量惊人。
 
5.    固相微萃取(SPME)模块能否用来定量?
可以。早期在 GC 气相色谱上使用的 SPME,寿命通常很短,对气相组分富集的效果和重现性不佳,造成人们定量不好的印象。后来适用于 LCMS 液质的 SPME 经学术界和公司的改进,可兼容有机溶剂,对液相内的组分富集重现性明显提高,定量结果可靠。DART® 配置的 SPME 针与 LCMS 使用的类似,但通量更高,可自动化进样。故 SPME 模块既能定量痕量组分,又能高通量处理复杂基质样品。
 
6.    固相微萃取(SPME)技术,萃取时间有多快?通量是否还能更高?
目前 DART® 配备的商品化 SPME 富集针(Sigma公司代为生产),10分钟左右即能达到最大吸附量的70%,建议萃取时间为20至30分钟。在美国质谱年会(ASMS2017)上展出的新一代 SPME 技术,萃取时间可以缩短至1-2分钟,通量又有大幅度的提高!
 
整个 SPME 富集加 DART® 分析过程,针对生物样品,可在5分钟左右完成。如自动匀浆及离心(可快至 30-45 秒)、若必须添加有机溶剂匀浆(如组织类样品)可先用全自动氮吹(2-3分钟)吹干(若不用有机溶剂,则这一步可省略)、SPME(1-2分钟)、DART(3-5秒)。若一次处理12- 或 96- 个样品,则均摊到每个样品的时间,远远小于3分钟。
 
7.    用与不用 SPME,DART® 的检出限分别能达到多少?如果将 DART® 接在 QE 或者 QTOF 上,检出限能达到多少?
SPME- DART® 使用 QQQ 串级定量质谱,对大多数化合物的灵敏度都能到 ppt 级别;不用 SPME 能到 0.3 ppb 级别(安捷伦6410类质谱仪)。DART® 对大部分有机物,灵敏度超过 LCMS(如针对塑化剂、激素、氨基酸、农药等)、或与 LCMS 差不多(如针对极性药物);DART® 对蛋白质没有响应,盐和溶剂无影响。
 
QE 及 QTOF(接LC-或ESI离子源)定量不如 QQQ,这类定性质谱的线性范围只有2-3个数量级。比 QQQ 少,灵敏度也比 QQQ 低。这是质谱仪本身的限制,和 ESI 离子源或 DART® 离子源无关。
 
8.    使用固相微萃取(SPME)对复杂基质进行富集时,是否会出现基质使活性涂层饱和,而目标物无法富集的情况?
SPME 是非常成熟的技术,不是任何物质都能被吸附富集。被吸附的分子要有亲和能力及适当的大小尺寸;没有亲和能力或大小不合适的盐、淀粉、蛋白、高分子聚合物等,不会被键合相吸附,所以不必担心基质占据涂层;能被吸附富集的只可能是小分子目标物。
 
若目标物浓度太高,有可能饱和。不过浓度过高时,也不需要用 SPME。使用 SPME 的目的是通过富集低丰度组分从而达到适合质谱分析的浓度或量的范围。早年的研究,都对其适用性和题目中的疑问做了解答。即没有这些问题。
 
9.    固相微萃取(SPME)模块能否直接富集有机溶剂(如乙腈、乙酸乙酯)中的提取物?
从原理上讲,SPME 萃取是在水溶液或生物样品的匀浆内进行的;在有机溶剂中无法进行。有机溶剂的萃取液可先行用氮吹仪快速浓缩,去除有机相,再加水定容,以 SPME 富集。
 
LCMS 使用的 SPME 需要用有机溶剂洗脱被富集的组分,而 DART®-SPME是将富集组分直接离子化,无需有机溶剂的洗脱,操作更简单。DART®-SPME 已发表应用文献,流程简单,无需担心使用方面的问题。
 
10.  如何清洗玻棒?
超声清洗即可,按超纯水-丙酮-甲醇-超纯水的顺序,每步1-3分钟,最后自然风干。
若是全石英玻棒,除超声清洗外,也可选择使用马弗炉,700℃ 左右烘烤5-10分钟即可。
没有马弗炉时,为彻底去除玻棒表面的残留,可用高锰酸钾或双氧水与浓硫酸配成洗液清洗,配置与使用方法可联系获取。
 
11.  常规离子源可以看二级碎片,用 DART® 离子源能看二级碎片吗?如何实现?
可以看。方法有二:
1) 使用有 MSMS 功能的质谱如 QE、QTOF、QQQ 等,DART® 选择母离子(相比 LCMS无加合盐和基质效应),利用质谱的 MSMS 功能,做二级碎片。
 
2) 没有二级质谱功能,如单杆,可以利用源内裂解方案,使用源内裂解电压,生成子离子碎片。再利用质谱仪的空白背景扣除功能,得出二级碎片谱。
 
12.  含有大量蛋白质的样品(如肉制品),其中的蛋白质是否会影响到目标物的检测?
DART® 是通过激发态的亚稳粒子(He或N2气)热传导脱附及后续离子化实现质子转移的技术。蛋白质难以被气化或脱附成为气相离子,所以 DART® 对蛋白质没有效果,即对蛋白质没有信号。优点是蛋白质无干扰,不足是做不了蛋白质,可以用传统的液质方法解决。
 
虽然蛋白质在 DART® 下无响应,但会包裹住小分子(如血液里的血红蛋白),所以需要通过前处理去除蛋白质(如在血液样品里加乙腈进行蛋白质沉淀)。要明确的是,这些方法是为释放出待测物分子,并不是为消除蛋白质的信号。
 
13.  如果样品的基质成分(如脂肪)被电离,生成的离子是否会对质谱造成污染?
不会。首先,液相色谱200微升/分的流动相里含有 10-5 M 氯化钠及大量管路里的塑化剂等,即使不进样品,所有离子和雾滴都会进入质谱的进样口,仅流动相的背景就达到106 级(cps, count per second)。考虑到了样品及流动相的复杂性,质谱公司均设计了吹扫气和帘气等保护措施,使质谱仪不易被外界污染。
 
DART® 离子化,没有流动相,只有高纯气,远比流动相干净。另外,DART® 设计了 VAPUR 接口,可能存在的固体颗粒会随高纯气一起被正交抽离。而生成的离子,无论来自待测物还是基质,都不会污染质谱,即离子不是质谱污染的原因。
 
且 DART® 蘸取方式的进样量只有不到0.5微升,通过近年来的使用已经证明没有污染的可能,比 LCMS 好很多。
 
14.  粉末类样品不经处理直接进样,颗粒是否会污染质谱?
不会污染。粉末样品直接进样的前提,是通过液体的粘附性保证它的附着,不会扬起飘散。而且附着的颗粒仅是与工作气流接触到的表面部分发生离子化,生成的离子通过电场和真空梯度进入质谱仪。颗粒被正交真空泵抽离。没有污染问题。
 
15.  颗粒物即使被 VAPUR 接口的真空泵抽离,是否仍会有一部分进入质谱?
不会进入。对固体颗粒物和 ESI 的残余喷雾液滴,各质谱公司均设计了专利保护措施,如反吹气和帘气罩,或源内锥孔附近的电场,或亚大气压环境条件,或加热离子通道,都会排除掉颗粒物和残余液滴。
 
16.  关于目标物的定量检测,尤其是固体样品,如何定量?
通常所说的定量其实与分析化学家的日常工作无二:液体定容、标曲、外标或内标法定量。 DART® 所配的有中通量模块(TM 透射模块、QuickStri p模块)、高通量模块(96位),准确体积加样如2微升,实现定量。即使是使用12-dip-it 玻棒蘸取液体进样,通过内标的使用对体积进行了校正,也能实现定量。
 
若要对固体做定量,需将固体样品先行溶解,与传统的 HPLC、LCMS、GCMS一致。用 DART® 的好处是离子化广谱,没有歧视、不需要顾虑太多 LCMS 的溶剂和缓冲盐问题,因为DART® 耐盐抗溶剂。
 
若不想溶解直接定量,可以用中国药科大学盛教授发明的压片法(内标或外标研磨均匀)进行 DART® 固体定量。这个方法是唯一能通过质谱定量固体粉末的技术,传统的 HPLC、LCMS、GCMS 则做不到。当然,若习惯了液体定量,就遵循上面分析化学的习惯。
 
17.  如何确定 DART® 质谱系统的进样条件?
以串接四级杆质谱为例,对大多数化合物, DART® 的产物与 ESI 中产生的部分分子离子一致,均为 M+H或 M-H 的母离子,可直接套用原有的方法(当然 ESI 还会生产许多杂乱的离子如盐的加合离子等等)。
 
若是之前没用 ESI 检测过的未知物,摸索DART®-MS条件的流程与液质一样。首先通过全扫描找出母离子,然后通过子离子扫描观察碎片离子,选定离子对,调节碰撞电压,最后按优化的参数编辑 MRM方法。使用 HRMS 如 QE 或 QTOF 则简单的多,如同LC-MS根据精确质量计算,寻找M+H或 M-H 的母离子。有时会有加铵或减水的分子离子峰。
 
摸索 DART® 的条件较简单,仅需要确定 DART® 温度。对于溶剂,DART® 并没有什么限制,一般的常见溶剂均可使用。
 
18.  若某些化合物在 DART® -MS上没有信号,该如何继续?
如果是浓度较低的原因,可适当加大浓度;如已排除浓度的影响,需判断 DART® 温度是否合适,某些化合物的适宜温度范围较窄,低于或高出均不合适,需稍微摸索下。通常350°C 是个很好的初试温度。
 
也可在溶剂里尝试添加0.1%甲酸(正模式)和或1 Mm 醋酸铵(负模式)辅助离子化;如果有化合物结构上的影响如多糖,可尝试原位或即时(in-situ) 衍生化如 TMAH 的全甲基化保护。
 
19.  DART® 是否有相关谱库?或有哪些谱库可以使用?
DART®-MS的一项明显优势是谱图非常简单,没有加钠或加钾的金属离子加合物,也没有盐等的干扰,谱图通常仅含有分子离子峰(M+H或M-H),易于识别分子量或进行 MSMS 子离子扫描。
 
DART® 已经有了 NIST(美国国家标准与技术研究院)的法医类谱库,其中包含800多种化合物,每种化合物有4种不同的裂解电压,可供搜库匹配。用户也可建立自己的谱库。
 
某些开放的谱库,如 METLIN 库现在已有几十万种化合物,可参考使用。更专业的DART®-MS 和 DART®-MSMS 商业谱库还要一段时间方能面世。
 
20.  DART® 有什么配置,该如何选择?
根据客户需求,有高配、中配、标配、手动、等不同型号的配置,具体可联系客户经理。
 
21.  DART® 源的拆装是否方便?
非常简单,对质谱真空无影响,三分钟完成拆装或源体互换。用户经简单培训后可自行拆装。
 
22.  同一厂家早期和近期型号的质谱,接口通用吗?
这要看质谱厂家的自带的 ESI 离子源部分是否有设计变动。如 ESI 源没有变化则通用;如 ESI 源已经有了硬件设计上的变化,如 Thermo 的 Fusion Lumos 的 ESI 源被称为 Ion Max NG,与 LTQ、QE 等的 Ion Max 源不一致,这时 DART® 就无法共用一套接口;需订购对应的新接口。
 
23.  若后续采购更好的高分辨质谱,DART® 是否可以在不同质谱间移换使用?
可以。只需配置相应质谱型号的接口,三分钟即可互换,轻松实现 DART® 在不同质谱间的转移兼容。
 
24.  DART® 为新型离子化方式,应用面是否够广?我怎么没听说过?
DART® 于2005年商品化,在原位质谱技术中领军优势明显。近八百个实验室同时使用,包括国内上百家政府、三方检测、研究院、大学、医院等实验室,成果显著,交流充分,技术日臻成熟。
 
此外,已经召开了四届的中国原位质谱会议(AIMS)也提供了极佳的学术交流平台。
 
DART® 技术应用和支持非常及时迅速,大多数问题都会在第一时间响应解答。应用合作与项目开展也非常积极,比如技术团队在与某省出入境检验检疫技术中心的研究合作,即使用 DART® 来灵敏检测保健品与化妆品里的抗生素、西药添加、激素、营养素等等,充分发挥了 QE 和 5500 QTRAP 的潜能,提升了高端质谱仪的可用性,大大提升了效率。

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点击阅读:
DART 原位质谱 Q&A 第1期
DART 原位质谱 Q&A 第2期